Тома

Нами выявлен бактериальный штамм Brevundimonas mongoliensis 53, который является продуцентом новой крупнощепящей эндонуклеазы рестрикции, названной BmoI. Фермент BmoI узнает семинуклеотидную палиндромную последовательность ДНК 5’-GG↓GWCCC-3’ (W = A или T) и расщепляет ее как указано стрелкой, образуя трехнуклеотидные 5’-выступающие «липкие» концы. BmoI является изошизомером ранее описанной эндонуклеазы рестрикции SanDI . Штамм-продуцент идентифицировали по морфологическим и биохимическим признакам, а также по анализу первичной структуры фрагмента гена 16S рРНК. Препарат эндонуклеазы рестрикции BmoI с концентрацией 2000 е.а./мл был получен путем очистки в три хроматографические стадии. Оптимальными условиями работы фермента являются SE-буфер W (10 мМ Трис-HCl (pH 8,5), 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ) и температура реакции 37°С.

Нами обнаружен бактериальный штамм Paracoccus species 12, который является продуцентом новой эндонуклеазы рестрикции, названной PecI. Этот фермент узнает шестинуклеотидную палиндромную последовательность ДНК 5’-TTA^TAA-3’ и расщепляет ее с образованием «тупых» концов, как показано стрелкой. Таким образом, PecI является истинным изошизомером рестриктазы PsiI . Препарат эндонуклеазы рестрикции PecI с концентрацией 10000 ед/мл был получен путем очистки в четыре хроматографические стадии. Оптимальными условиями реакции фермента являются SE-буфер 5 (Y) (33 мМ Трис-ацетат (pH 7.9), 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ K-ацетат, 1 mM ДТТ) и температура 37oС.

ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan зонда (ПЦР РВ) является одним из основных методов анализа структуры ДНК человека и широко используется в медицине. В данной работе проводили ПЦР РВ 4-х фрагментов геномной ДНК человека (chr1: 90717178-90717300, chr9: 97464604-97464756, chr11: 65647215-65647307, chr17: 4560027-4560175), используя в качестве матрицы препараты ДНК из крови человека, полученные как стандартным методом фенольной депротеинизации, так и выделенные на колонках. В ПЦР использовались как препараты исходной ДНК, так и после ее обработки рестриктазой, выщепляющей амплифицируемый фрагмент. В случае препаратов нативной ДНК, очищенных на колонках, ПЦР на 3-х из 4-х фрагментов ДНК дает завышенное значение Cq. В случае фенольной очистки завышенное значение Cq для препаратов нативной ДНК получается для 2-х из 4-х фрагментов ДНК. В случае препаратов ДНК, полученных после очистки на колонке, обработка ДНК эндонуклеазой рестрикции, вырезающей амплифицируемый фрагмент,…

В настоящей работе описано клонирование сайт-специфической метилзависимой ДНК-эндонуклеазы GlaI и проведено сравнение субстратной специфичности рекомбинантного и нативного ферментов. Проведённый анализ свойств рекомбинантной эндонуклеазы GlaI показал, что субстратная специфичность нативного и рекомбинантного фермента не отличаются, но, ввиду большего количества фермента в рекомбинантном штамме, его концентрация в конечном препарате более чем в 10 раз превышает концентрацию нативного фермента

Выделенный нами из природных изолятов бактериальный штамм Lysinibacillus manganicus An22 является продуцентом эндонуклеазы рестрикции LmnI, узнающей непалиндромную последовательность ДНК 5’-GCTCC-3’/3’-CGAGG-5’. Данная последовательность представляет собой новый прототип сайтов узнавания рестриктаз. Препарат эндонуклеазы рестрикции LmnI с концентрацией 1000 ед/мл был получен путем очистки в четыре хроматографические стадии. Показано, что новый фермент гидролизует ДНК с образованием 3’-выступающих “липких” двухнуклеотидных концов как показано стрелками - 5’-GCTCCN↓-3’/3’-CGAG↑GN-5’, и относится к подтипу IIS эндонуклеаз рестрикции.