Новые ферменты

Нами выявлен бактериальный штамм Brevundimonas mongoliensis 53, который является продуцентом новой крупнощепящей эндонуклеазы рестрикции, названной BmoI. Фермент BmoI узнает семинуклеотидную палиндромную последовательность ДНК 5’-GG↓GWCCC-3’ (W = A или T) и расщепляет ее как указано стрелкой, образуя трехнуклеотидные 5’-выступающие «липкие» концы. BmoI является изошизомером ранее описанной эндонуклеазы рестрикции SanDI . Штамм-продуцент идентифицировали по морфологическим и биохимическим признакам, а также по анализу первичной структуры фрагмента гена 16S рРНК. Препарат эндонуклеазы рестрикции BmoI с концентрацией 2000 е.а./мл был получен путем очистки в три хроматографические стадии. Оптимальными условиями работы фермента являются SE-буфер W (10 мМ Трис-HCl (pH 8,5), 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ) и температура реакции 37°С.

Нами обнаружен бактериальный штамм Peribacillus species 31, который является продуцентом новой эндонуклеазы рестрикции, названной Pse31I. Фермент узнает шестинуклеотидную непалиндромную последовательность ДНК 5’-GGTCTC-3’и расщепляет ее в стороне от сайта узнавания в позициях 1/5: 5’-GGTCTC(N)1^/3’-CCAGAG(N)5^-5’. Таким образом, Pse31I является истинным изошизомером рестриктазы Eco31I . Штамм-продуцент идентифицировали по морфологическим и биохимическим признакам, а также по анализу первичной структуры фрагмента гена 16S рРНК. Pse31I имеет максимальную активность при 37°С и инактивируется инкубацией при 55 и 65°С. Фермент не расщепляет сайты с метилированным цитозином в верхней цепи (5’-GGTCT(5mC)-3’) и/или в нижней цепи (3’-(5mС)CAGAG). Оптимальными условиями работы фермента являются SE-буфер 5 (Y) (33 мМ Трис-ацетат (pH 7,9), 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ K-ацетат, 1 мМ ДТТ) и температура 37°С

Нами обнаружен бактериальный штамм Paracoccus species 12, который является продуцентом новой эндонуклеазы рестрикции, названной PecI. Этот фермент узнает шестинуклеотидную палиндромную последовательность ДНК 5’-TTA^TAA-3’ и расщепляет ее с образованием «тупых» концов, как показано стрелкой. Таким образом, PecI является истинным изошизомером рестриктазы PsiI . Препарат эндонуклеазы рестрикции PecI с концентрацией 10000 ед/мл был получен путем очистки в четыре хроматографические стадии. Оптимальными условиями реакции фермента являются SE-буфер 5 (Y) (33 мМ Трис-ацетат (pH 7.9), 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ K-ацетат, 1 mM ДТТ) и температура 37oС.

Выделенный нами из природных изолятов бактериальный штамм Lysinibacillus manganicus An22 является продуцентом эндонуклеазы рестрикции LmnI, узнающей непалиндромную последовательность ДНК 5’-GCTCC-3’/3’-CGAGG-5’. Данная последовательность представляет собой новый прототип сайтов узнавания рестриктаз. Препарат эндонуклеазы рестрикции LmnI с концентрацией 1000 ед/мл был получен путем очистки в четыре хроматографические стадии. Показано, что новый фермент гидролизует ДНК с образованием 3’-выступающих “липких” двухнуклеотидных концов как показано стрелками - 5’-GCTCCN↓-3’/3’-CGAG↑GN-5’, и относится к подтипу IIS эндонуклеаз рестрикции.