Эндонуклеаза рестрикции SegI из бактериального штамма Sphingobium erigeronicola 46 узнает октануклеотидную последовательность ДНК 5′-RTGC^GCAY-3′ и является изошизомером FspAI

ВВЕДЕНИЕ

Сайт-специфические эндонуклеазы рестрикции типа II расщепляют двуцепочечную ДНК внутри или рядом с сайтом узнавания, образуя «липкие» или «тупые» концы [2], благодаря чему они широко применяются в молекулярной биологии и генетической инженерии. В представленной работе описан новый крупнощепящий фермент данного типа SegI, который узнаёт восьминуклеотидную палиндромную вырожденную последовательность ДНК 5’-RTGCGCAY-3’, где R – пурин, Y – пиримидин, и расщепляет её посередине с образованием «тупых» концов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовались реактивы производства “Sigma-Aldrich” (США), “Fisher” (Германия), “Panreac” (Испания), “Диа-М” и “Хеликон” (Россия). Для хроматографической очистки фермента применялись следующие носители: фосфоцеллюлоза P-11 и гепарин-сефароза (“Sigma-Aldrich”, США), гидроксилапатит (BioRad, США). Для выращивания бактериальных клеток использовались компоненты питательной среды производства ”Organotechnie” (Франция).

Для экспериментов брали эндонуклеазы рестрикции, полинуклеотидкиназу фага Т4, препараты ДНК фагов λ и Т7, плазмиду pBR322, маркеры молекулярного веса ДНК, SE-буфер для разбавления ферментов “B100”, реакционные SE-буферы “B”, “G”, “O”, “W”, “Y”, “ROSE” производства ООО “СибЭнзайм” (Россия).

Морфологические и физико-биохимические свойства штамма изучали с использованием методик [3]. Определение рода микроорганизма проводили по определителю Берджи [4], в котором данный род ещё не был представлен, и по результатам секвенирования ПЦР-фрагмента гена 16S рРНК.

Для определения места гидролиза межнуклеотидных связей использовали [³²P]-меченый ДНК-дуплекс, содержащий сайт узнавания целевого фермента. Исходные олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы в ООО “БИОССЕТ” (Россия) и метились с помощью Т4-полинуклеотидкиназы. Для разделения продуктов ферментативного гидролиза меченых олигонуклеотидов применяли электрофорез в 20% ПААГ, содержавшем 8 М мочевину.

Выращивание штамма-продуцента.

Штамм-продуцент выращивали в конических колбах на 500 мл, содержащих по 300 мл LM-бульона: 1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl, 0,05% MgCl₂ и 0,001% тиамин – при 28^oС со встряхиванием в течение двух суток до насыщения. Клетки собирали центрифугированием на центрифуге Beckman J2-MI (США) в роторе JA-10 при 8000 об/мин в течение 20 мин и замораживали при -20^oС.

Очистка препарата эндонуклеазы рестрикции SegI.

Условия проведения выделения и используемые буферы. Выделение проводили при +4^oС с использованием растворов на основе буферов:

• буфер А — 10 мМ Трис-HCl, pH 7,6; 0,1 мМ ЭДТА; 7 мМ β-меркаптоэтанол;
• буфер Б — 10 мМ К-фосфат, pH 7,5; 0,1 мМ ЭДТА; 7 мМ β-меркаптоэтанол.

Экстрагирование. 27 г биомассы суспендировали в 125 мл буфера А, содержащего 0,2 M NaCl, 1 мг/мл лизоцим, 0,1 мМ PMSF (фенилметил-сульфонилфторид – ингибитор протеаз). После 1 часа перемешивания на магнитной мешалке суспензию в стеклянном стакане на 150 мл термостатировали в ледяной бане, и затем клетки разрушали ультразвуком при максимальной мощности с амплитудой 22–24 мкм на приборе Soniprep 150 («MSE», Англия) с насадкой диаметром 2 см шестью импульсами по 1 мин с интервалом 1 мин. Экстракт осветляли на центрифуге J2-М1 («Beckman», США) в течение 30 мин в роторе JA-20 при 15000 об/мин.

Хроматография на фосфоцеллюлозе Р-11. Колонку с фосфоцеллюлозой, объёмом 30 мл, промывали 60 мл буфера А с 0,2 М NaCl. Сорбированный материал элюировали линейным градиентом концентрации NaCl 0,3–0,7 М в буфере А, объёмом 500 мл. Собирали 50 фракций по 10 мл. Объединяли фракции, содержащие максимум целевой активности и наносили на колонку с гидроксилапатитом объёмом 3 мл, уравновешенную буфером Б.

Хроматография на гидроксилапатите. Колонку промывали 10 мл буфера Б. Фермент элюировали линейным градиентом 10–150 мМ калий–фосфатного буфера (рН 7,5) c 0,05 M NaCl объёмом 100 мл. Собирали 40 фракций по 2,5 мл. Объединяли фракции с максимальной активностью и наносили на колонку с гепарин-сефарозой, объёмом 5 мл, предварительно уравновешенную буфером А с 0,2 М NaCl.

Хроматография на гепарин-сефарозе. Колонку промывали 10 мл буфера А с 0,2 М NaCl. Сорбированный материал элюировали линейным градиентом концентрации NaCl 0,2–0,6 М в буфере А, объёмом 120 мл. Собирали 50 фракций по 2,5 мл.

Концентрирование и хранение препарата.

Фракции, содержащие максимальную активность, объединяли, к ним добавляли BSA до концентрации 0,2 мг/мл и диализовали против 200 мл концентрирующего буфера (10 мМ Трис-HCl, pH 7,6; 0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ β-меркаптоэтанол, 0,2 М NaCl, 50% глицерин) при перемешивании на магнитной мешалке в течение 16 ч. Полученный препарат SegI хранили при минус 20°С.

Тестирование рестриктазной активности SegI.

В качестве субстрата для анализа активности SegI использовали ДНК фага T7, имеющую два сайта узнавания фермента. При тестировании активности рестриктазы в хроматографическом профиле аликвоты по 1 мкл из фракций добавляли к 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкг ДНК T7 в SE-буфере W (10 мМ Трис-HCl, (pH 8,5 при 25°С), 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ), инкубировали смесь в течение 15 мин при 37^oС. Продукты реакции наносили на 0,8% агарозный гель и проводили электрофорез в Трис-ацетатном буфере (50 мМ Трис-ацетат (pH 8,0), 20 мМ Na-ацетат, 2 мМ ЭДТА) при напряжении 150V. После окрашивания бромистым этидием гель фотографировали в УФ-свете. За единицу активности рестриктазы принимали минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага T7 в SE-буфере W при 37^oС в 50 мкл реакционной смеси за 1 час.

При определении позиции гидролиза ДНК ферментом SegI использовали [³²P]-меченый с 5’-конца олигонуклеотидный дуплекс Seg1/Seg2, длиной 22 п.н., содержащий сайт узнавания SegI и сайты узнавания контрольных ферментов, образованный из дезоксирибоолигонуклеотидов со следующей структурой:

Seg1: 5’-GGTTTTCATGCGCATGTTTTGG-3’

Seg2: 5’-CCAAAACATGCGCATGAAAACC-3’

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика и таксономическая идентификация штамма-продуцента.

Штамм-продуцент выделен из пробы пресной воды. На LM-агаре за 3 дня при 24^oС образует колонии круглые до 2 мм, выпуклые, блестящие, полупрозрачные, жёлтые. Клетки палочковидные, 0,6 х 2–3 мкм, подвижные, грамотрицательные, каталазоположительные, оксидазоотрицательные. Растут в аэробных условиях при температуре от 8 до 30^oС, не растут при 37^oС. Содержание 65±5% G+C в ДНК штамма определяли по [5]. Для идентификации штамма с его ДНК проводили ПЦР гена 16S рРНК с использованием праймеров 5’-agagtttgatcmtggctca-3’ и 5’-tacggytaccttgttacgact-3’, представляющих модификации fDl и rPl [6]. Секвенировали 2 фрагмента гена 16S рРНК длиной 511 и 626 пар нуклеотидов (рис. 1).

На основе установленной последовательности фрагментов гена 16S рРНК определили принадлежность штамма-продуцента к виду Sphingobium erigeronicola семейства Sphingobiaceae. Для этого использовали Nucleotide BLAST [7] и классификатор [8]. Микробиология штамма соответствовала его виду [9]. Штамм назвали Sphingobium erigeronicola 46, а выделенную из него рестриктазу по номенклатуре [10] – SegI.

Получение биомассы и выделение фермента.

Выход наработанной биомассы штамма Sphingobium erigeronicola 46 составил 7,5±0,5 г на 1 л культуральной жидкости. Таким образом, из 3,6 л культуральной жидкости получили 27 г биомассы с активностью целевого фермента 10000 е.а./г, которую замораживали при -20^oС. В результате трех стадий хроматографической очистки, описанной выше, получили 4 мл препарата SegI, который хранили при -20°С.

Чтобы определить субстратную специфичность новой рестриктазы, мы провели гидролиз этим ферментом трех ДНК. На рисунке 2 представлена картина гидролиза ЭР SegI ДНК фага λ, предварительно обработанной рестриктазой BssT1I (λ/BssT1I), ДНК фага Т7 и ДНК плазмиды pBR322. Реакционная смесь, объёмом 50 мкл, содержала 1 мкг субстратной ДНК в SE-буфере W и 1 мкл препарата SegI, инкубацию проводили в течение 1 ч при 37^oС.

Сравнение картины гидролиза новым ферментом вышеуказанных ДНК-субстратов (рис. 2) с теоретически рассчитанными картинами расщепления этих же ДНК известными к настоящему времени эндонуклеазами рестрикции позволило заключить, что ЭР SegI является изошизомером ранее описанной рестриктазы FspAI [1]. Этот фермент узнаёт восьминуклеотидную палиндромную вырожденную последовательность ДНК 5’-RTGCGCAY-3’ и имеет по два сайта узнавания на ДНК фагов λ, Т7 и плазмиде pBR322.

Определение оптимального буфера и температуры для SegI.

При определении оптимального буфера для работы рестриктазы SegI реакцию проводили в 50 мкл смеси, содержащей один из шести стандартных SE-буферов для эндонуклеаз рестрикции: B, G, O, W, Y и ROSE, 1 мкг ДНК фага Т7 с добавлением 0,5 или 1 мкл фермента, разбавленного в 5 раз SE-буфером «B100» и инкубацией в течение 1 ч при 37^oС. Результаты представлены на рисунке 3.

Из данного рисунка видно, что оптимальным буфером для SegI является SE-буфер W. В нём наблюдается полный гидролиз субстратной ДНК при добавлении 1 мкл разбавленного в пять раз фермента (дор. 10). В этом случае Т7 ДНК (39935 п.н.) расщепляется на три фрагмента 25453, 11071 и 3412 п.н. длиной. При неполном гидролизе появляются дополнительные фрагменты между 25453 и 11071 п.н. (сумма 11071 + 3412 п.н.), а также не разделившийся с 25453 п.н. фрагмент из суммы 25453 и 3412 п.н. Кроме того, полный гидролиз Т7 ДНК можно видеть и при использовании в реакции SE-буфера ROSE (дор. 14). Итоговые результаты анализа активности фермента в шести стандартных SE-буферах при температуре 37^oС представлены в таблице 1.

Для определения оптимальной температуры реакции проводили инкубацию рестриктазы SegI в 50 мкл смеси, содержащей SE-буфер W и 1 мкг ДНК фага Т7 с добавлением 0,5, 1 или 2 мкл фермента, разбавленного в 5 раз SE-буфером «B100». Инкубацию реакционной смеси осуществляли в течение 1 ч при 25, 30, 37 или 55^oС. В качестве контрольной точки при каждой температуре использовали гидролизат Т7 ДНК в SE-буфере W, полученный с 1 мкл неразбавленного фермента. Результаты представлены на рисунке 4.

Как видно из рис. 4, полный гидролиз субстратной ДНК во всех разведениях фермента наблюдается при температуре 37^oС (дор. 11-14). Эту температуру можно считать оптимальной для ЭР SegI. Фермент также эффективно работает и при температурах 25 и 30^oС (дор. 2-5 и 6-9, соответственно). В то время, как при температуре 55^oС уже не наблюдается полного гидролиза ДНК разбавленной рестриктазой (дор. 15-17), хотя фермент и сохраняет не менее 50% активности. При этом полная инактивация ЭР SegI в реакционной смеси происходила при нагревании до 65^oС за 20 мин (данные не приведены).

Из данных, представленных на рисунках 3 и 4, следует, что за единицу активности рестриктазы SegI можно принять минимальное количество фермента, которое необходимо для полного расщепления 1 мкг ДНК фага Т7 в реакционной смеси объёмом 50 мкл за 1 ч в SE-буфере W при 37°С.

На рисунке 5 приведена электрофореграмма анализа активности ЭР SegI при оптимальной температуре (37°С) в оптимальном SE-буфере W.

Из рисунка видно, что полный гидролиз субстратной ДНК наблюдается в случаях, когда в реакционную смесь добавляли 1 или 2 мкл разбавленной в пять раз ЭР SegI (дор. 5 и 6, соответственно). Следовательно, активность полученного препарата фермента составляет не менее 5 е.а./мкл или 5000 е.а./мл.

Определение позиции гидролиза ДНК ферментом SegI.

Чтобы определить место гидролиза ДНК новым ферментом, мы использовали радиоактивно меченый с 5’-конца олигонуклеотидный дуплекс Seg1*/Seg2, длиной 22 п.н. (меченая цепь отмечена «*»), содержащий сайт узнавания SegI (подчёркнут):

Данный дуплекс расщепляли новым ферментом SegI и отдельно контрольными ферментами SmiMI (5’-CAYNN↓NNRTG-3’), HspAI (5’-G↓CGC-3’), AspLEI (5’-GCG↓C-3’) (позиции гидролиза дуплекса этими ферментами указаны выше стрелками).

Реакцию проводили с 1 пмоль дуплекса Seg1*/Seg2 в 10 мкл реакционной смеси в течение 1 ч при 37°С в реакционном SE-буфере W с добавлением 1 мкл одного из ферментов. Продукты гидролиза наносили на 20% ПААГ с 8М мочевиной и проводили электрофорез в Трис-боратном буфере. На рисунке 6 представлена авторадиограмма геля после электрофореза.

Из данных, представленных на рисунке 6, следует, что позиция гидролиза SegI совпадает с позицией гидролиза SmiMI (5’-CATGC↓GCATG-3’) (дор. 3 и 4) и отличается на один нуклеотид, как от позиции гидролиза AspLEI (продукт расщепления идёт выше, дор. 5), так и от места расщепления ферментом HspAI (продукт идёт ниже, дор. 2). Следовательно, можно сделать вывод о том, что SegI расщепляет последовательность узнавания посередине симметрично на обеих цепях: 5’-CATGC↓GCATG-3’/3’-GTACG↓CGTAC-5’, с образованием «тупых» концов.

Большинство из идентифицированных на сегодняшний день прототипов [2] распознают нуклеотидные последовательности длиной 4–6 п.н. К настоящему времени известно только около полутора десятков прототипов, сайты узнавания которых составляют 8 пар нуклеотидов, среди которых были обнаружены истинные палиндромы, прерванные палиндромы или палиндромы с вырожденными позициями.

Описываемый в настоящей статье фермент узнаёт вырожденный палиндром. Данная группа ферментов является редкой, и описано всего несколько подобных прототипов (например, FspAI, SgrAI, PspXI). Вероятно, рестриктазы с подобным сайтом узнавания в ходе эволюции образуются из эндонуклеаз с палиндромным шестинуклеотидным сайтом.

В пользу этого предположения указывает тот факт, что шестинуклеотидная последовательность 5’-TGCGCA-3’ (узнаётся MstI, Acc16I, FspI), входящая в состав сайта узнавания FspAI и SegI, специфично расщепляется ферментом MstI и его изошизомерами с образованием аналогичных «тупых» концов, как у рестриктаз FspAI и SegI.

Описываемый в настоящей статье новый фермент SegI может найти применение для крупноблочной фрагментации ДНК в области генетической инженерии, молекулярной биологии, биотехнологии и ДНК-диагностики.

ЛИТЕРАТУРА

1. Kesminiene A., Maneliene Z., Vitkute J., Petrusyte, M., Janulaitis A. FspAI, a unique type II restriction endonuclease that recognizes the octanucleotide sequence 5′-RTGC^GCAY-3′ // Nucleic Acids Res. – 2001. – V. 29: e120.
2. Pingoud A., Fuxreiter M., Pingoud V. and Wende W. Type II restriction endonucleases: structure and mechanism // CMLS, Cell. Mol. Life Sci. – 2005. – Vol. 62. – P. 685–707. – 1420-682X/05/060685-23. – DOI 10.1007/s00018-004-4513-1.
3. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Под ред. Н.С. Егорова. М., 1995.
4. Определитель бактерий Берджи. Под ред. Дж. Хоулта и др.: 9-е издание в 2-х томах. Пер. с англ. под ред. Г.А. Заварзина. М., 1997.
5. Дедков В.С. Определение содержания G+C в ДНК бактерий при помощи эндонуклеаз рестрикции // Биотехнология. – 2004. – № 4. – С. 77-82.
6. Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study // J. Bacteriol. – 1991. – Vol. 173. – P. 697–703., DOI: 10.1128/jb.173.2.697-703.1991.
7. Nucleotide BLAST. URL: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov
8. NCBI Taxonomy Browser URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/
9. Jeong C.R., and Kim, S.B. Description of Sphingobium wonjuense sp. nov. isolated from mountain soil and Sphingobium erigeronicola sp. nov. isolated from plant root // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. – 2026. – V. 76(3).
10. Smith, H.O. and Nathans D. A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes. // J. Mol. Biol. – 1973. – V. 81. – P. 419-423.