Эндонуклеаза рестрикции EmiI, изошизомер Ksp632I, узнает непалиндромную последовательность ДНК 5’-CTCTTC(1/4)-3’

ВВЕДЕНИЕ

Эндонуклеазы рестрикции IIS-типа [3] специфически расщепляют ДНК вне сайта узнавания, образуя уникальные липкие концы, что позволяет их применять в некоторых технологиях генетической инженерии и молекулярной биологии. Данная работа посвящена описанию новой эндонуклеазы рестрикции EmiI, узнающей непалиндромную шестинуклеотидную последовательность ДНК 5’-CTCTTC(N)₁↓/3’-GAGAAG(N)₄↓-5’ и расщепляющей ее, как показано стрелками.

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

В работе использовались реактивы производства “Sigma-Aldrich” (США), “Fisher” (Германия), “Panreac” (Испания), “Диа-М” и “Хеликон” (Россия). Для хроматографической очистки фермента применялись следующие носители: фосфоцеллюлоза P11 и гепарин-сефароза (“Sigma-Aldrich ”, США), гидроксилапатит (“Bio-Rad”, США). Для выращивания бактериальных клеток использовались компоненты питательной среды фирмы ”Organotechnie” (Франция). Для экспериментов брали эндонуклеазы рестрикции, Т4 полинуклеотидкиназу, препараты ДНК фагов λ и Т7, маркеры молекулярного веса ДНК, реакционные SE-буферы для эндонуклеаз рестрикции «B100», «B», «G», «O», «W», «Y», «ROSE» производства ООО “СибЭнзайм” (Россия).

Морфологические и физико-биохимические свойства штамма изучали с использованием методик [4]. Определение рода микроорганизма проводили по определителю Берджи [5] и по результатам секвенирования ПЦР-фрагмента гена 16S рРНК.

Тестирование рестриктазной активности EmiI

В качестве субстрата для анализа активности EmiI использовали ДНК фага λ. При тестировании активности рестриктазы в хроматографическом профиле аликвоты по 1 мкл из фракций добавляли к 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкг ДНК фага λ в SE-буфере Y, инкубировали смесь в течение 15 мин при 37^oС. При тестировании активности очищенного препарата EmiI брали 1 мкл неразбавленного фермента или 1 и 2 мкл препарата, разбавленного в 10 раз SE-буфером «B100» (10 мМ Трис-HCl, (pH 7,6), 50 мМ KCl, 0,1 мМ ЭДТА, 200 мкг/мл BSA, 1 мМ ДТТ, 50% глицерин). Фермент добавляли к 50 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкг ДНК фага λ и один из шести реакционных буферов для эндонуклеаз рестрикции. Смесь инкубировали в течение 1 ч при 37^oС, продукты реакции наносили на 1% агарозный гель и проводили электрофорез в Трис-ацетатном буфере (50 мМ Трис-ацетат (pH 8,0), 20 мМ Na-ацетат, 2 мМ ЭДТА) при напряжении 180V. После окрашивания бромистым этидием гель фотографировали в УФ-свете. За единицу активности рестриктазы принимали минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага λ в SE-буфере Y при 37^оС в 50 мкл реакционной смеси за 1 час.

Чтобы определить место гидролиза межнуклеотидных связей в ДНК изучаемым ферментом использовали олигонуклеотидный [³²P]-меченый ДНК-дуплекс, содержащий сайт узнавания EmiI и сайты узнавания контрольных ферментов. Для разделения продуктов ферментативного гидролиза меченых олигонуклеотидов применяли электрофорез в 20% ПААГ, содержавшем 8 М мочевину.

Выращивание клеток штамма E. mexicanum 6

Штамм E. mexicanum 6 выращивали в 20 литровом ферментёре (New Brunswick, США) в LM-бульоне, содержащем: 1% триптон (Organotechnie, Франция), 0,5% дрожжевой экстракт (той же фирмы), 0,5% NaCl, 0,05% MgCl₂ и 0,001% тиамин, при 30^оС с перемешиванием и аэрацией 5 ч до ОП₅₅₀ = 3. Клетки собирали центрифугированием на центрифуге Beckman J2-MI (США) в роторе JA-10 при 8000 об/мин в течение 20 мин и замораживали при -20^оС.

Выделение эндонуклеазы рестрикции Emil

Условия проведения выделения и используемые буферы. Выделение проводили при +4^оС с использованием растворов на основе буферов:

• буфер А — 10 мМ Трис-HCl, pH 7,6; 0,1 мМ ЭДТА и 7 мМ β-меркаптоэтанол;
• буфер Б — 10 мМ К-фосфат, pH 7,3; 0,1 мМ ЭДТА и 7 мМ β-меркаптоэтанол.

Экстрагирование. 17 г биомассы суспендировали в 60 мл буфера А, содержащего 0,1M NaCl, 1 мг/мл лизоцим, 0,1 мМ PMSF (фенилметилсульфонилфторид – ингибитор протеаз). После 2 часов перемешивания суспензии в стеклянном стакане на 150 мл в ледяной бане на магнитной мешалке клетки разрушали ультразвуком при максимальной мощности с амплитудой 22–24 мкм на приборе Soniprep 150 («MSE», Англия) с насадкой диаметром 2 см семью импульсами по 60 сек с интервалом 2 мин. Экстракт осветляли на центрифуге J2-М1 («Beckman», США) в течение 30 мин в роторе JA-20 при 15000 об/мин.

 Хроматография на фосфоцеллюлозе Р-11. Осветленный экстракт наносили на колонку с фосфоцеллюлозой P11, объемом 60 мл, предварительно уравновешенной буфером А с 0,1М NaCl, колонку промывали 120 мл буфера А с 0,1М NaCl. Сорбированный материал элюировали линейным градиентом концентрации NaCl 0,1–0,8 М в буфере А, объемом 600 мл.  Собирали 60 фракций по 10 мл. Объединяли фракции, содержащие максимум активности (42-54).

Хроматография на гидроксилапатите.  Объединенную фракцию наносили на колонку с гидроксилапатитом объемом 8 мл, уравновешенным буфером Б с 50 мМ NaCl и промывали 15 мл того же буфера. Фермент элюировали линейным градиентом 20–300 мМ калий–фосфата в буфере Б c 50 мМ NaCl объемом 300 мл. Собирали 50 фракций по 6 мл. Фракции с максимальной активностью (24-29) объединяли и диализовали  против 2 л буфера А в течение 1,5 ч.

Хроматография на гепаринсефарозе.  Объединенную фракцию после диализа наносили на колонку с гепарин-сефарозой объемом 5 мл, предварительно уравновешенной буфером А с 50 мМ NaCl и промывали 10 мл того же буфера. Сорбированный материал элюировали линейным градиентом концентрации NaCl 50–800 мМ в буфере А объемом 80 мл. Собирается 40 фракций по 2 мл. Фракции, содержащие максимальную активность фермента (18-23), объединяли.

Концентрирование и хранение препарата

В объединенную фракцию добавляли BSA до концентрации 0,2 мг/мл, после чего проводили диализ против 200 мл концентрирующего буфера (10 мМ Трис-HCl, pH 7,6; 0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ β-меркаптоэтанол, 0,2 М NaCl, 50% глицерин) при перемешивании на магнитной мешалке в течение 16 ч. Препарат хранили при минус 20°С

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика и таксономическая идентификация штамма.

Штамм-продуцент выделен из воды пруда. На LM-агаре за 3 дня при 24^оС образует круглые колонии до 4 мм в диаметре. Колонии конически-выпуклые, блестящие, непрозрачные, бледно-оранжевые. Клетки палочковидные, 0,6 х 3 – 4 мкм, подвижные, грамположительные, каталазоположительные, оксидазоотрицательные. Растут в аэробных условиях при температуре от 8 до 40^оС, не растут при 55^оС. Содержание 53±5% G+C в ДНК штамма определяли по [6].

Для идентификации штамма по 16S рРНК из клеток штамма выделяли ДНК и проводили ПЦР гена 16S рРНК с использованием праймеров 5’-agagtttgatcmtggctca-3’ и 5’-tacggytaccttgttacgact-3’, представляющих модификации fDl и rPl [7]. Секвенировали ПЦР-фрагмент длиной 721 п.н. части гена 16S рРНК (рис. 1).

На основе установленной последовательности фрагмента гена 16S рРНК определили принадлежность штамма-продуцента к Exiguobacterium mexicanum семейства Bacillales Family XII. Incertae Sedis. Для этого использовали Nucleotide BLAST [8], определитель SILVAngs [9] и классификатор [10]. Микробиология штамма соответствовала его роду [11]. Штамм назвали Exiguobacterium mexicanum 6, а выделенную из него рестриктазу, по номенклатуре, EmiI.

Получение препарата фермента EmiI и изучение его свойств.

В результате наработки культуры клеток штамма E. mexicanum 6 из 20 л среды получили 64 г биомассы с активностью EmiI 50 000 ед./г. После трёх стадий хроматографической очистки из 17 г биомассы было получено 3 мл препарата эндонуклеазы рестрикции EmiI с концентрацией 5000 е.а./мл.

В ходе дальнейшей работы нами были определены оптимальные условия для работы фермента. Для этого использовали реакционную смесь объемом 50 мкл, содержащую 1 мкг ДНК фага λ, один из шести буферов для эндонуклеаз рестрикции и 1 или 2 мкл препарата фермента EmiI, разбавленного в 10 раз SE-буфером «B100». Смесь инкубировали при температуре 37^oС в течение 1 ч. Результаты приведены на рисунке 2.

Из рисунка 2 видно, что фермент проявляет максимальную активность в SE-буфере Y (33 мМ Трис-ацетат (pH 7,9), 10 мМ магний-ацетат, 66 мМ калий-ацетат, 1 мМ ДТТ), поскольку в нем наблюдается полный гидролиз субстратной ДНК при добавлении как 1, так и 2 мкл разбавленного в 10 раз фермента (дор.10-11). Во всех остальных случаях 1 мкл разбавленного препарата EmiI недостаточно для исчерпывающего гидролиза ДНК. Полученные результаты анализа активности фермента в шести SE-буферах при температуре 37^оС представлены в таблице 1.

Сравнение полученной с помощью EmiI картины гидролиза ДНК фага λ с теоретически рассчитанными данными расщепления ее последовательности по сайтам эндонуклеаз рестрикции позволило сделать вывод, что фермент EmiI является изошизомером рестриктаз Ksp632I [1] и Bst6I [2], которые гидролизуют данный субстрат по сайту 5’-CTCTTC-3’/3’-GAGAAG-5’.

Чтобы подтвердить специфичность нового фермента мы провели сравнительный гидролиз ДНК фагов λ и Т7 эндонуклеазами рестрикции EmiI и Bst6I в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкг ДНК в SE-буфере Y и 1 мкл препарата ЭР Bst6I либо EmiI. После инкубации реакционных смесей при 65^оС (для Bst6I) или 37^оС (для EmiI) в течение 1 ч аликвоты по 15 мкл наносили на 1% агарозный гель и проводили электрофорез. Результаты представлены на рисунке 3.

Из рисунка видно, что картины гидролиза обеих ДНК рестриктазами Bst6I и EmiI полностью совпадают, что подтверждает их одинаковую специфичность.

При определении оптимальной температуры для работы ЭР EmiI проводили инкубацию в 50 мкл реакционной смеси 1 мкг ДНК фага λ в SE-буфере Y и 1 мкл исходного или 1 мкл разбавленного в 10 раз препарата фермента в течение 1 ч при температурах 25, 30, 37, или 55^оС.  Результаты представлены на рисунке 4.

Как видно из рис.4, полный гидролиз субстратной ДНК 1 мкл неразбавленного препарата EmiI наблюдается при любой из проверяемых температур (дор. 2, 4, 6, 8). Тогда как в реакции с разбавленным в 10 раз ферментом только при 37^oС можно наблюдать исчерпывающий гидролиз субстрата ферментом (дор. 7). Следовательно, данная температура является оптимальной для активности рестриктазы EmiI. При этом полная инактивация ЭР EmiI происходила при нагревании реакционной смеси до 80^oС за 20 мин (данные не приведены).

На основании полученных результатов можно определить активность препарата EmiI. На рисунке 5 приведена электрофореграмма анализа активности целевого фермента при оптимальной температуре (37°С) в оптимальном SE-буфере Y.

Из рисунка видно, что исчерпывающий гидролиз рестриктазой EmiI λ ДНК наблюдается при добавлении 2 мкл разбавленного в 10 раз препарата фермента (дор. 4) или 1 мкл неразбавленного препарата фермента (дор. 5). Таким образом, можно сделать заключение, что активность исследуемого препарата ЭР EmiI составляет 5 е.а./мкл (5000 е.а./мл). За единицу активности рестриктазы EmiI принимали минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага λ в реакционной смеси объемом 50 мкл за 1 ч в SE-буфере Y при 37°С.

Чтобы подтвердить сайт узнавания ЭР EmiI и определить место гидролиза ДНК новым ферментом мы использовали 2 радиоактивно меченых с 5’-конца олигонуклеотидных дуплекса Emi1*/Emi2 и Emi2*/Emi1 (меченая цепь отмечена «*»), образованные из двух олигонуклеотидов, содержащих сайт узнавания EmiI (подчеркнут):

Emi1: 5’-CCTTTGACGCTCTTCGGCGCCATGATG CAA CC-3’
Emi2: 5’-GGTTGCATCATGGCGCCGAAGAGCGTCAAAGG -3’

Данный дуплекс расщепляли новым ферментом EmiI и, отдельно, контрольными ферментами Bst6I (5’-CTCTTC(1/4)-3’), HgaI (5’-GACGC(5/10)-3’), HspAI (5’-G↓CGC-3’), FaeI (5’-CATG↓-3’), SfaNI (5’-GCATC(5/9)-3’). Реакцию проводили с 1 пмоль дуплексов Emi1*/Emi2 и Emi2*/Emi1 в 10 мкл реакционной смеси в течение 1 ч при 37°С (для Bst6I при 55°С) в реакционном SE-буфере Y. Продукты гидролиза наносили на 20% ПААГ с 8М мочевиной и проводили электрофорез в Трис-боратном буфере. На рисунке 6А представлен авторадиограмма геля после электрофореза.

На рисунке 6Б приведена структура дуплекса Emi1/Emi2 с указанием сайтов узнавания и позиций гидролиза ЭР, используемых для анализа. Для удобства сайты узнавания и стрелочки, обозначающие позиции гидролиза, для каждой ЭР выделены отдельным цветом. Для каждой цепи дуплекса ферменты были подобраны так, чтобы их позиции гидролиза либо совпадали (как у Bst6I) с предполагаемой позицией гидролиза EmiI, либо отличались на 1 нуклеотид с 5’-конца (HgaI для верхней цепи и FaeI для нижней цепи) или на 1 нуклеотид с 3’-конца (HspAI для верхней цепи и SfaNI для нижней цепи).

Из данных, представленных на рисунке 6А, следует, что позиция гидролиза EmiI совпадает с позицией гидролиза Bst6I (5’-CTCTTCN↓-3’/3’-GAGAAGNNNN↓-5’) и отличается на 1 нуклеотид в ту или другую сторону, соответственно, от позиций гидролиза контрольных ферментов.

Таким образом, эндонуклеаза рестрикции EmiI из штамма бактерии Exiguobacterium mexicanum 6 узнает шестинуклеотидную непалиндромную последовательность ДНК 5’-CTCTTC-3’ и расщепляет ее в стороне от сайта узнавания в позициях 5’-CTCTTC(N)₁↓-3’/3’-GAGAAG(N)₄↓-5’ с образованием 5’-выступающих трехнуклеотидных концов, как и в случае ранее описанных рестриктаз Ksp632I и Bst6I. Новый фермент может применяться для исследований в области генетической инженерии, молекулярной биологии, биотехнологии и ДНК-диагностики.

Список литературы

1. Bolton B.J., Schmitz G.G., Jarsch M., Comer M.J., Kessler C. Ksp632I, a novel class-IIS restriction endonuclease from Kluyvera sp. strain 632 with the asymmetric hexanucleotide recognition sequence: 5′-CTCTTC(N)1-3′ 3′-GAGAAG(N)4-5′. Gene. Jun 15; 66(1) (1988) 31-43. DOI 10.1016/0378-1119(88)90222-3
2. Эндонуклеаза рестрикции Bst6I // http://sibenzyme.com/product/bst6-i/
3. Pingoud A., Fuxreiter M., Pingoud V. and Wende W. Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 62 (2005) 685–707. 1420-682X/05/060685-23. DOI 10.1007/s00018-004-4513-1.
4. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Под ред. Н.С. Егорова. М., 1995.
5. Определитель бактерий Берджи. Под ред. Дж. Хоулта и др.: 9-е издание в 2-х томах. Пер. с англ. под ред. Г.А. Заварзина. М., 1997.
6. Дедков В.С. Определение содержания G+C в ДНК бактерий при помощи эндонуклеаз рестрикции // Биотехнология. – 2004. – № 4. – С. 77-82.
7. Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study // J. Bacteriol. – 1991. – Vol. 173. – P. 697 – 703., DOI: 10.1128/jb.173.2.697-703.1991.
8. Nucleotide BLAST. URL: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov
9. SILVAngs. URL: https://www.arb-silva.de/aligner
10. NCBI Taxonomy Browser URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/
11. Raichand R., Pareek S., Singh N.K., Mayilraj S. Exiguobacterium aquaticum sp. nov., a member of the genus Exiguobacterium // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. – 2012. – V. 62. – P. 2150-2155. DOI: 10.1099/ijs.0.035790-0