Эндонуклеаза рестрикции BmoI из штамма бактерии Brevundimonas mongoliensis 53 узнает последовательность ДНК 5’-GG^GWCCC-3’

ВВЕДЕНИЕ.

Эндонуклеазы рестрикции II типа специфически расщепляют ДНК внутри или рядом с сайтом узнавания и широко применяются в молекулярной биологии, ДНК-диагностике и генно-инженерных работах. Данная работа посвящена описанию новой крупнощепящей эндонуклеазы рестрикции BmoI, узнающей семинуклеотидную палиндромную последовательность ДНК 5’-GG↓GWCCC-3’/3’-CCCWG↓GG-5’ и расщепляющей ее, как показано стрелками.

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

В работе использовались реактивы производства “Sigma-Aldrich” (США), “Fisher” (Германия), “Panreac” (Испания), “Диа-М” и “Хеликон” (Россия). Для хроматографической очистки фермента применялись следующие носители: фосфоцеллюлоза P11, гепарин-сефароза (“Sigma”, США). Для выращивания бактериальных клеток использовались компоненты питательной среды фирмы ”Organotechnie” (Франция). Для экспериментов брали эндонуклеазы рестрикции, полинуклеотидкиназу фага Т4, препарат ДНК фага Т7, маркеры молекулярного веса ДНК, реакционные SE-буферы для эндонуклеаз рестрикции «B100», «B», «G», «O», «W», «Y», «ROSE» производства ООО “СибЭнзайм” (Россия).

Морфологические и физико-биохимические свойства штамма изучали с использованием методик [2]. Определение рода микроорганизма проводили по определителю Берджи [3] и по результатам секвенирования ПЦР-фрагмента гена 16S рРНК.

Тестирование рестриктазной активности BmoI.
В качестве субстрата для анализа активности BmoI использовали ДНК фага T7. При тестировании активности рестриктазы в хроматографическом профиле аликвоты по 1 мкл из фракций добавляли к 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкг ДНК фага T7 в SE-буфере W, инкубировали смесь в течение 15 мин при 37°С. Продукты реакции наносили на 1% агарозный гель и проводили электрофорез в Трис-ацетатном буфере (50 мМ Трис-ацетат (pH 8,0), 20 мМ Na-ацетат, 2 мМ ЭДТА) при напряжении 180V. После окрашивания бромистым этидием гель фотографировали в УФ-свете. За единицу активности рестриктазы принимали минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага T7 в SE-буфере W при 37°С в 50 мкл реакционной смеси за 1 час.

Чтобы определить место гидролиза межнуклеотидных связей в ДНК изучаемым ферментом, использовали олигонуклеотидный [32P]-меченый ДНК-дуплекс, содержащий сайт узнавания BmoI и сайты узнавания контрольных ферментов. Для разделения продуктов ферментативного гидролиза меченых олигонуклеотидов применяли электрофорез в 20% ПААГ, содержавшем 8 М мочевину.

Выращивание клеток штамма B. mongoliensis 53.
Штамм B. mongoliensis 53 выращивали в LM/4-бульоне, содержащем 0,25% триптон (Organotechnie, Франция), 0,13% дрожжевой экстракт (той же фирмы), 0,13% NaCl, 0,013% MgCl₂ и 0,0003% тиамин. Рассевали на LM/4-агаре – 1,5% агар (C.E. Roeper GmbH, Германия) в LM/4-бульоне. Среды готовили по 0,3 л в 0,5-литровых конических колбах. Для получения биомассы культуру выращивали в колбах с бульоном при 28°С со встряхиванием 2 дня. Клетки собирали центрифугированием на центрифуге Beckman J2-MI (США) в роторе JA-10 при 4°С, 8000 об/мин в течение 20 мин. С 7 л получали 25 г биомассы, которую замораживали при -20°С.

Выделение эндонуклеазы рестрикции BmoI.
Условия проведения выделения и используемые буферы. Выделение проводили при +4°С с использованием растворов на основе буфера:

• буфер А — 10 мМ Трис-HCl pH 7,5; 0,1 мМ ЭДТА и 7 мМ β-меркаптоэтанол.

Экстрагирование. 10 г биомассы B. mongoliensis 53 суспендировали в 50 мл буфера А, содержащего 0,2 М NaCl, 1 мг/мл лизоцим, 0,1 мМ PMSF (фенилметил-сульфонилфторид – ингибитор протеаз). После 1 часа перемешивания на магнитной мешалке суспензию в стеклянном стакане на 100 мл термостатировали в ледяной бане и затем клетки разрушали ультразвуком при максимальной мощности с амплитудой 22–24 мкм на приборе Soniprep 150 («MSE», Англия) с насадкой диаметром 2 см десятью импульсами по 30 сек с интервалом 2 мин. Экстракт осветляли на центрифуге J2-М1 («Beckman», США) в течение 40 минут в роторе JA-20 при 15000 об/мин.

Хроматография на фосфоцеллюлозе Р-11. Экстракт наносили на колонку с 10 мл фосфоцеллюлозы P-11 и промывали 60 мл буфера А с 0,2 М NaCl. Сорбированный материал элюировали линейным градиентом концентрации NaCl от 0,2 до 0,6 М в буфере А, объёмом 600 мл. Собирали 60 фракций по 10 мл. Объединяли фракции, содержащие максимум целевой активности (№ 13–21), и диализовали против 1,5 л буфера А в течение 2 ч.

Хроматография на гепарин-сефарозе. Объединённую фракцию после диализа наносили на колонку с гепарин-сефарозой объёмом 4 мл, уравновешенной буфером А с 0,05 М NaCl. Колонку промывали 10 мл того же буфера. Сорбированный материал элюировали линейным градиентом концентрации NaCl от 0,05 до 0,5 М в буфере А, объёмом 120 мл, собирали 40 фракций по 3 мл. Фракции, содержащие максимум активности BmoI (№ 31–36), объединяли и диализовали против 0,8 л буфера А в течение 2 ч.

Рехроматография на фосфоцеллюлозе Р-11. Объединённую фракцию после диализа повторно наносили на колонку с фосфоцеллюлозой P-11 объёмом 10 мл, уравновешенной буфером А с 0,2 М NaCl. Колонку промывали 20 мл того же буфера. Сорбированный материал элюировали линейным градиентом NaCl от 0,2 до 0,6 М в буфере А, объёмом 120 мл. Собирали 40 фракций по 3 мл. Фракции, содержащие максимальную активность фермента (№ 15–21), объединяли.

Концентрирование и хранение препарата BmoI. Объединённую фракцию после диализа диализовали против 350 мл концентрирующего буфера (10 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 0,05 М NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ β-меркаптоэтанол, 50% глицерин) при перемешивании на магнитной мешалке в течение 16 ч. Препарат хранили при –20°С.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика и таксономическая идентификация штамма.
Штамм выделен из образца почвы. На LM/4-агаре за 3 дня при 24°С образует круглые колонии до 1 мм в диаметре. Колонии выпуклые, блестящие, полупрозрачные, бледно-оранжевые. Клетки палочковидные, 0,3 × 2–3 мкм, неподвижные, грамотрицательные, слабокаталазоположительные, оксидазоположительные. Растут в аэробных условиях при температуре от 8 до 30°С и не растут при 37°С. Содержание G+C в ДНК штамма (67±5%) определяли по [4].

Для идентификации штамма по 16S рРНК из клеток штамма выделяли ДНК и проводили ПЦР гена 16S рРНК с использованием праймеров 5’-agagtttgatcmtggctca-3’ и 5’-tacggytaccttgttacgact-3’, представляющих модификации fDl и rPl [5]. Секвенировали 1425 нуклеотидов части гена 16S рРНК (Рис. 1).

На основе установленной последовательности фрагмента гена 16S рРНК определили принадлежность штамма-продуцента к Brevundimonas mongoliensis семейства Caulobacteraceae. Для этого использовали Nucleotide BLAST [6], определитель SILVAngs [7] и классификатор [8]. Морфология штамма соответствовала его виду [9]. Штамм назвали Brevundimonas mongoliensis 53, а выделенную из него рестриктазу, по номенклатуре, BmoI.

Получение препарата фермента BmoI и изучение его свойств.
В результате наработки культуры клеток штамма B. mongoliensis 53 из 7 л питательной среды получили 25 г биомассы. Активность целевого фермента в биомассе составила 2800 ед./г. После трёх стадий хроматографической очистки из 10 г биомассы было получено 4 мл препарата эндонуклеазы рестрикции BmoI с концентрацией 2000 е.а./мл.

В ходе дальнейшей работы нами были определены оптимальные условия для работы фермента. Для этого использовали реакционную смесь объемом 50 мкл, содержащую 1 мкг ДНК фага T7, один из шести буферов для эндонуклеаз рестрикции и 0,5, 1 или 2 мкл препарата фермента BmoI, разбавленного в 2 раза SE-буфером «B100» (10 мМ Трис-HCl, (pH 7,6), 50 мМ KCl, 0,1 мМ ЭДТА, 200 мкг/мл BSA, 1 мМ ДТТ, 50% глицерин). Смесь инкубировали при температуре 37oС в течение 1 ч. Результаты приведены на рисунке 2.

Из рисунка 2 видно, что фермент проявляет максимальную активность в SE-буфере W (10 мМ Трис-HCl (pH 8,5), 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ), поскольку только в нем наблюдается полный гидролиз субстратной ДНК с образованием трёх фрагментов при добавлении как 1, так и 2 мкл разбавленного в 2 раза фермента (дор.12-13). Во всех остальных случаях 1 мкл разбавленного препарата BmoI недостаточно для исчерпывающего гидролиза ДНК. Полученные результаты анализа активности фермента в шести SE-буферах при температуре 37^оС представлены в таблице 1.

Сравнение полученной с помощью BmoI картины гидролиза ДНК фага T7 с теоретически рассчитанными данными расщепления ее последовательности по сайтам эндонуклеаз рестрикции позволило сделать вывод, что фермент BmoI является изошизомером рестриктазы SanDI, которая гидролизует данный субстрат по сайту 5’-GGGWCCC-3’ с образованием трёх фрагментов длиной 26794, 10989 и 2198 п.н. На ДНК фага λ сайты 5’-GGGWCCC-3’ отсутствуют, поэтому мы не наблюдаем гидролиза этого субстрата после его обработки ЭР BmoI (Рис. 3).

При определении оптимальной температуры для работы ЭР BmoI проводили инкубацию в 50 мкл реакционной смеси 1 мкг ДНК фага T7 в SE-буфере W и 0,5 или 1 мкл препарата фермента при различных температурах: 25, 30, 37, 45 или 55°С. Результаты представлены на рисунке 4.

Как видно из рис.4, полный гидролиз субстратной ДНК наблюдается при температуре 37^оС (дор. 7), которая является оптимальной для активности рестриктазы BmoI. В то же время полная инактивация ЭР BmoI в реакционной смеси происходила при нагревании до 65^oС за 20 мин (данные не приведены).

Из результатов, представленных на рисунках 2, 3 и 4, следует, что за единицу активности рестриктазы BmoI можно принять минимальное количество фермента, которое необходимо для полного расщепления 1 мкг ДНК фага T7 в реакционной смеси объемом 50 мкл за 1 ч в SE-буфере W при 37°С.

На рисунке 5 приведена электрофореграмма анализа активности целевого фермента при оптимальной температуре (37°С) в оптимальном SE-буфере W.

Поскольку мы наблюдаем исчерпывающий гидролиз ферментом Т7 ДНК на дорожках 2, 3 и 4, можно сделать заключение, что активность полученного препарата ЭР BmoI составляет 2 е.а./мкл (2000 е.а./мл).

Чтобы определить место гидролиза ДНК новым ферментом и подтвердить его специфичность мы использовали двуцепочечный радиоактивно-меченый с 5’-конца олигонуклеотидный дуплекс Bmo_SfaN*/  Bmo_SfaNk (меченая цепь отмечена *), содержащий сайт узнавания BmoI (выделен жирным и подчеркнут). Данный дуплекс содержит также сайты узнавания контрольных эндонуклеаз рестрикции SfaNI (5’-GCATC-3’(5/9), AspS9I (5’-G↓GNCC-3’) и BstF5I (5’-GGATG(2/0)-3’), расщепляющих его в позициях, указанных ниже стрелками:

Меченый дуплекс расщепляли новым ферментом BmoI и отдельно контрольными ферментами SfaNI, AspS9I и BstF5I. Реакцию проводили с 1 пмоль дуплекса Bmo_SfaN*/ Bmo_SfaNk в 10 мкл реакционной смеси в течение 1 ч при 37°С в реакционном SE-буфере Y с добавлением 1 мкл одного из ферментов. Продукты гидролиза (по 10 мкл) наносили на 20% ПААГ с 8М мочевиной и проводили электрофорез в Трис-боратном буфере. На рисунке 6 представлена авторадиограмма геля после электрофореза.

Из данных, представленных на рисунке 6, следует, что позиция гидролиза BmoI совпадает с позицией гидролиза AspS9I (5’-G↓GNCC-3’). Следовательно, можно сделать вывод о том, что BmoI расщепляет последовательность узнавания между вторым и третьим гуанином симметрично на обеих цепях: 5’-GG↓GWCCC-3’/3’-CCCWG↓GG-5’.

Таким образом, фермент BmoI из штамма бактерии Brevundimonas mongoliensis 53 узнает семинуклеотидную палиндромную последовательность ДНК 5’-GG↓GWCCC-3’ и расщепляет ее после второго гуанина, образуя, таким образом трехнуклеотидные 5’-выступающие «липкие» концы. BmoI является изошизомером ранее описанной эндонуклеазы рестрикции SanDI и может применяться для исследований в области генетической инженерии, молекулярной биологии, биотехнологии и ДНК-диагностики.

Список литературы

1. Timothy G. Simcox, Linda Fabian, Keith Kretz, Valerie Hedden, Mary Ellen C. Simcox. SanDI, a new type-II restriction endonuclease that recognizes 5′-GGGWCCC-3′ // Gene. – 1995. – V. 155 (1). – P. 129–130. DOI: 10.1016/0378-1119(94)00711-Z.
2. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Под ред. Н.С. Егорова. М., 1995.
3. Определитель бактерий Берджи. Под ред. Дж. Хоулта и др.: 9-е издание в 2-х томах. Перевод с англ. под ред. Г.А. Заварзина. М., 1997.
4. Дедков В.С. Определение содержания G+C в ДНК бактерий при помощи эндонуклеаз рестрикции // Биотехнология. – 2004. – № 4. – С. 77–82.
5. Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study // J. Bacteriol. – 1991. – Vol. 173. – P. 697–703. DOI: 10.1128/jb.173.2.697-703.1991.
6. Nucleotide BLAST. URL:https://blast.ncbi.nlm.nih.gov.
7. SILVAngs. URL:https://www.arb-silva.de/aligner.