Новая сайт-специфическая эндонуклеаза рестрикции AlsI из Aquipseudomonas alcaligenes 51 узнает октануклеотидную палиндромную последовательность ДНК 5’-TTT^TAAAA-3’

ВВЕДЕНИЕ

Рестриктазы типа II специфически расщепляют ДНК внутри или рядом с сайтом узнавания, формируя уникальные «липкие» или «тупые» концы и широко применяются в молекулярной биологии. В данной работе описан новый фермент-прототип AlsI, узнающий октануклеотидную палиндромную последовательность 5’-TTTTAAAA-3’ и расщепляющий её с образованием 5’-выступающих TA-концов.

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Выращивание штамма-продуцента.

Штамм Aquipseudomonas alcaligenes 51 выращивали в LM-бульоне, содержащем 1% триптон (Organotechnie, Франция), 0,5% дрожжевой экстракт (той же фирмы), 0,5% NaCl, 0,05% MgCl₂ и 0,001% тиамин.  Рассевали на LM-агаре – 1,5% агар (C.E. Roeper, Gmbh, Германия) в LM-бульоне. Среды готовили по 0,3 л в 0,5-литровых конических колбах.  Для получения биомассы культуру выращивали в термостатированной качалке в колбах с бульоном при 28^оС со встряхиванием 24 часа при частоте встряхивания 120 об/мин. Клетки собирали центрифугированием на центрифуге Beckman J2-MI (США) в роторе JA-10 при 4^оС, 8000 об/мин в течение 20 мин.

Очистка препарата эндонуклеазы рестрикции AlsI.

Условия проведения выделения и используемые буферы. Выделение проводили при +4^оС с использованием растворов на основе буферов:

• буфер А — 10 мМ Трис-HCl, pH 7,6; 0,1 мМ ЭДТА; 7 мМ β-меркаптоэтанол;
• буфер Б -10 мМ К-фосфат, pH 7,5; 0,1 мМ ЭДТА; 7 мМ β-меркаптоэтанол.

Экстрагирование. 21 г биомассы суспендировали в 100 мл буфера А, содержащего 0,2 M NaCl, 1 мг/мл лизоцим, 0,1 мМ PMSF (фенилметил-сульфонилфторид – ингибитор протеаз). После 1 часa перемешивания на магнитной мешалке суспензию в стеклянном стакане на 100 мл термостатировали в ледяной бане и затем клетки разрушали ультразвуком при максимальной мощности с амплитудой 22–24 мкм на приборе Soniprep 150 («MSE», Англия) с насадкой диаметром 2 см 8 импульсами по 90 сек с интервалом в 90 сек. Экстракт осветляли на центрифуге J2-М1 («Beckman», США) в течение 35 минут в роторе JA-20 при 15000 об/мин.

Хроматография на фосфоцеллюлозе P11.  Экстракт разбавляли в 4 раза буфером А, переносили на колонку, заполненную 50 мл сорбента, уравновешенного буфером А, содержащим 0,05 М NaCl. Промывали колонку 50 мл того же буфера. Сорбированный материал элюировали линейным градиентом концентрации NaCl от 0,05 М до 0,9 М в буфере А, объемом 800 мл. В результате элюции было собрано 80 фракций по 10 мл. Фракции, содержащие максимум активности, собирали и наносили на колонку с гидроксилапатитом, объемом 5 мл, уравновешенную буфером Б.

Хроматография на гидроксилапатите.  Колонку промывали 10 мл буфера Б. Фермент элюировали линейным градиентом 10–300 мМ калий–фосфатного буфера (рН 7,5) в буфере Б, объемом 200 мл. В результате было собрано 50 фракций по 3 мл. Фракции с максимальной активностью объединяли, разбавляли в 3 раза, а затем наносили на колонку с гепарин-сефарозой, объемом 2 мл, предварительно уравновешенной буфером А с 0,05 М NaCl.

Хроматография на гепарин-сефарозе. Колонку промывали 8 мл буфера А с 0,05 М NaCl. Сорбированный материал элюировали линейным градиентом концентрации NaCl от 0,05 М до 0,7 М в буфере А, объемом 40 мл.  В результате было собрано 20 фракций по 2 мл, из которых были отобраны фракции, содержащие максимум активности.

Концентрирование и хранение препарата.

К объединенным фракциям добавляли BSA до концентрации 0,1 мг/мл и диализовали против 150 мл концентрирующего буфера (10 мМ Трис-HCl, pH 7,6; 0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ β-меркаптоэтанол, 0,2 М NaCl, 50% глицерин) при перемешивании на магнитной мешалке в течение 16 ч.

Тестирование рестриктазной активности AlsI.

В качестве субстрата для анализа активности AlsI использовали ДНК фага Лямбда, гидролизованную рестриктазой BglI (λ/BglI). При тестировании активности рестриктазы в хроматографическом профиле аликвоты по 1 мкл из фракций добавляли к 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкг ДНК λ/BglI в SE-буфере Y, инкубировали смесь в течение 15 мин при 37^oС. Продукты реакции наносили на 0,8% агарозный гель и проводили электрофорез в Трис-ацетатном буфере (50 мМ Трис-ацетат (pH 8,0), 20 мМ Na-ацетат, 2 мМ ЭДТА) при напряжении 120 или 150V. После окрашивания бромистым этидием гель фотографировали в УФ-свете. За единицу активности рестриктазы принимали минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК λ/BglI в SE-буфере Y при 37^оС в 50 мкл реакционной смеси за 1 час.

Для определения позиции гидролиза ДНК ферментом AlsI использовали радиоактивно-меченый с 5’-конца олигонуклеотидный дуплекс G51-BstF5/G51-BstF5k, содержащий сайт узнавания AlsI и сайты узнавания контрольных ферментов, образованный из олигонуклеотидов со следующей структурой:

G51-BstF5:   5’-GAAССТСGGATGTTTTAAAAGAACAG-3’
G51-BstF5k: 5’-CTGTTCTTTTAAAACATCCGAGGTTC-3’

         Для подтверждения последовательности сайта узнавания использовали два олигонуклеотидных дуплекса, содержащих сайт узнавания DraI, фланкированный с 5’ и 3’ концов нуклеотидами G-T и A-C, либо C-G, соответственно. Дуплексы образованы из олигонуклеотидов со следующей структурой:

G51GT:  5’-CCCAAGGATGTTTAAATCCAACAC-3’
G51GTk:   5’-GTGTTGGATTTAAACATCCTTGGG-3’
G51CG:    5’-CCCAAGGATCTTTAAAGCCAACAC-3’
G51CGk:  5’-GTGTTGGCTTTAAAGATCCTTGGG-3’.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

     Характеристика штамма-продуцента.

Новый бактериальный штамм Aquipseudomonas alcaligenes 51 выделили из почвы. После высева на LM-агаре за 3 дня при 24^оС аэробно вырастали круглые колонии до 3-4 мм в диаметре, выпуклые, блестящие, полупрозрачные, зеленовато-жёлтые. Колонии росли при температуре от 8 до 30^оС (оптимально, 25^оС), но не при 37^оС. Клетки палочковидные, 0,7 х 2-3 мкм, подвижные, грамотрицательные, каталазоотрицательные, оксидазоположительные. 70±5% G+C в ДНК определили по [2].

Для идентификации штамма из его клеток выделяли ДНК по [3] и проводили ПЦР гена 16S рРНК с использованием праймеров

5’-agagtttgatcmtggctca-3’ и 5’-tacggytaccttgttacgact-3’, представляющих модификацию fDl и rPl по [4]. Секвенировали 1409 нуклеотидов части гена 16S рРНК (рис. 1).

Используя Nucleotide BLAST [5] и SILVAngs [6], по сиквенсу гена 16S рРНК определили принадлежность штамма к виду бактерии Aquipseudomonas alcaligenes из семейства Pseudomonadaceae. Признаки штамма также соответствовали роду Aquipseudomonas [7, 8]. Штамм назвали Aquipseudomonas alcaligenes 51, а его рестриктазу по номенклатуре – AlsI.

Получение биомассы и выделение фермента.

Выход наработанной биомассы (см. «Материалы и методы») составил 3 г на 1 л культуральной жидкости. Таким образом, из 7 л культуральной жидкости получили 21 г биомассы с активностью 1500 е.а./г, которую замораживали при -20^оС.  В результате хроматографической очистки, описанной выше, получили 2 мл целевого препарата AlsI с активностью 1000 е.а./мл, который хранили при -20°С. На рисунке 2 представлена картина гидролиза ферментом AlsI исходной ДНК фага λ и ДНК фага λ, предварительно обработанной рестриктазой BglI (λ/BglI). Реакционная смесь, объемом 50 мкл, содержала 1 мкг λ ДНК или λ/BglI в SE-буфере Y и 1 мкл препарата AlsI, инкубацию проводили в течение 1 ч при 37^оС.

Определение оптимального буфера и температуры для AlsI.

При определении оптимального буфера для работы рестриктазы AlsI реакцию проводили в 50 мкл реакционной смеси, содержащей один из шести SE-буферов для эндонуклеаз рестрикции (B, G, O, W, Y или ROSE) и 1 мкг ДНК фага λ/BglI с добавлением 0,5 или 1 мкл фермента и инкубацией в течение 1 ч при 37^оС. Результаты представлены на рисунке 3.

Из данного рисунка видно, что оптимальным буфером для AlsI является SE-буфер Y (33 мМ Трис-ацетат (pH 7,9), 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ K-ацетат, 1 мМ ДТТ), в котором наблюдается полный гидролиз субстратной ДНК при добавлении 1 мкл фермента. Полученные результаты анализа активности фермента в SE-буферах при температуре 37^оС представлены в таблице 1.

Для определения оптимальной температуры реакции проводили инкубацию рестриктазы AlsI в 50 мкл смеси, содержащей SE-буфер Y и 1 мкг ДНК фага λ/BglI с добавлением 0,5 мкл препарата фермента. Инкубацию реакционной смеси осуществляли в течение 1 ч при 25, 30, 37, 45 или 55^оС.  В качестве контрольной точки использовали гидролизат λ/BglI в SE-буфере Y, полученный с 1 мкл фермента. Результаты представлены на рисунке 4.

Как видно из рис.4, наибольшая глубина гидролиза ДНК фага λ/BglI, близкая к картине полного гидролиза на дорожке 2, наблюдается при температуре 37 ^оС (дорожка 5). Таким образом, температура 37^оС является оптимальной для активности рестриктазы AlsI. При этом полная инактивация ЭР AlsI в реакционной смеси происходила при нагревании до 65^oС за 20 мин (данные не приведены).

Из результатов, представленных на рисунках 3 и 4, следует, что за единицу активности рестриктазы AlsI можно принять минимальное количество фермента, которое необходимо для полного расщепления 1 мкг ДНК фага λ/BglI в реакционной смеси объемом 50 мкл за 1 ч в SE-буфере Y при 37°С.

На рисунке 5 приведена электрофореграмма анализа активности целевого фермента при оптимальной температуре (37°С) в оптимальном SE-буфере Y.

Из данного рисунка видно, что полный гидролиз ДНК λ/BglI наблюдается в случаях, когда в реакционную смесь добавляли 2 или 1 мкл ЭР AlsI (дор.2 и 3, соответственно). Следовательно, активность полученного препарата фермента составляет 1 е.а./мкл.

Определение сайта узнавания фермента AlsI.

На рисунке 6 приведена картина расщепления ДНК фагов λ и Т7 эндонуклеазами рестрикции AlsI и DraI (сайт узнавания 5’-TTTAAA-3’), а также результат их совместного гидролиза.

Из данных, приведенных на рисунке 6, видно, что картина расщепления эндонуклеазой рестрикции DraI и совместного гидролиза DraI и AlsI не отличаются. Учитывая, что сайтом узнавания DraI является последовательность 5’-TTTAAA-3’, мы предположили, что AlsI расщепляет расширенную нуклеотидную последовательность, содержащую внутри себя этот гексануклеотид.

Теоретический анализ показывает, что при расщеплении ДНК фага λ по последовательности 5’-TTTTAAAA-3’ образуются фрагменты 25436, 12200 и 10866 п.н., которые соответствуют расщеплению ДНК фага λ ферментом AlsI (рис.2, дор.2). На ДНК фага Т7 такой октануклеотидной последовательности нет. Как видно из рисунка 6, AlsI не расщепляет ДНК фага Т7. Таким образом, нуклеотидная последовательность 5’-TTTTAAAA-3’ является возможным сайтом узнавания рестриктазы AlsI.

Всего ДНК фага λ содержит 13, а ДНК Т7 – 9 сайтов узнавания рестриктазы DraI, позиции которых приведены ниже в таблице 2. Сайты TTTTAAAA и их позиции в ДНК выделены жирным шрифтом:

Всего может быть 16 вариантов фланкирования сайта DraI, из которых 13 присутствуют в структуре ДНК фагов λ и Т7, а три варианта фланкирования, соответствующие последовательностям 5’-GTTTAAAT-3’, 5’-ATTTAAAC-3’ и 5’-СTTTAAAG-3’, в них отсутствуют. Поэтому возможность гидролиза последних проверялась отдельным экспериментом на соответствующих олигонуклеотдиных дуплексах, представленным ниже.

Определение позиции гидролиза ДНК ферментом AlsI.

Чтобы определить место гидролиза ДНК новым ферментом мы использовали радиоактивно меченый с 5’-конца олигонуклеотидный дуплекс G51-BstF5*/G51-BstF5k (меченая цепь отмечена «*»), содержащий сайт узнавания AlsI (подчеркнут):

Данный дуплекс расщепляли новым ферментом AlsI и отдельно контрольными ферментами DraI (5’-TTT^AAA-3’), Tru9I (5’-T^TAA-3’), BstF5 (5’-GGATG(2/0)-3’) (позиции гидролиза этими ферментами указаны выше стрелками).

Реакцию проводили с 1 пмоль дуплекса G51-BstF5*/G51-BstF5k в 10 мкл реакционной смеси в течение 1 ч при 37°С в реакционном SE-буфере Y с добавлением 1 мкл одного из ферментов. Продукты гидролиза наносили на 20% ПААГ с 8М мочевиной и проводили электрофорез в Трис-боратном буфере. На рисунке 7 представлена авторадиограмма геля после электрофореза.

Из данных, представленных на рисунке 7, следует, что позиция гидролиза AlsI совпадает с позицией гидролиза Tru9I (5’-T^TAA-3’). Следовательно, можно сделать вывод о том, что AlsI расщепляет последовательность между третьим и четвёртым тимином симметрично на обеих цепях: 5’-TTT^TAAAA-3’/3’-AAAAT^TTT-5’, с образованием 5’-выступающих TA-концов.

Как было установлено выше, в результате обработки ДНК фага λ рестриктазой AlsI расщепляются только сайты узнавания DraI, фланкированные с 5’-конца нуклеотидом T, а с 3’-конца нуклеотидом А, тогда как на ДНК фага Т7 новый фермент не расщепляет ни один из сайтов DraI. В то же время среди сайтов узнавания DraI на этих двух ДНК три варианта фланкирования, соответствующие последовательностям 5’-GTTTAAAT-3’, 5’-ATTTAAAC-3’ и 5’-СTTTAAAG-3’, не представлены.

Для подтверждения отсутствия гидролиза этих последовательностей AlsI мы обрабатывали ферментом два радиоактивно-меченых олигонуклеотидных дуплекса G51GT*/G51GTk и G51CG*/G51CGk, содержащих сайт узнавания DraI, фланкированный с 5’ и 3’ концов нуклеотидами G-T и A-C, либо C-G (выделены жирным, сайт узнавания DraI подчеркнут):

G51GT*/G51GTk:  

5’-CCCAAGGATGTTTAAATCCAACAC-3’
3’-GGGTTCCTACAAATTTAGGTTGTG-5’

G51CG*/G51CGk:  

5’-CCCAAGGATCTTTAAAGCCAACAC-3’
3’-GGGTTCCTAGAAATTTCGGTTGTG-5’

На рисунке 8 представлена авторадиограмма 20% ПААГ с 8М мочевиной после электрофореза продуктов обработки рестриктазой AlsI этих олигонуклеотидных дуплексов.

Из данных, приведенных на рисунке 8, следует, что при фланкировании последовательности узнавания DraI 5’-TTTAAA-3’ с 5’ и 3’ концов нуклеотидами G-T или C-G гидролиз субстрата рестриктазой AlsI не происходит. Расщепление сайта DraI с фланкирующими нуклеотидами A-C также не происходит, поскольку нет расщепления в комплементарной цепи с G-T. Таким образом, из всех возможных расширений сайта узнавания DraI только один вариант фланкирования узнается и расщепляется AlsI – последовательность 5’-TTTTAAAA-3’.

Нами также проводилось расщепление ДНК E.coli ER2267 рестриктазой AlsI. На рисунке 9 приведена электрофореграмма гидролизата ДНК, полученная после инкубации 8 мкл AlsI и 8 мкг хромосомной ДНК E.coli ER2267 в SE-буфере Y при 37°С в течение 2 ч в 80 мкл реакционной смеси. По окончании реакции гидролизованную ДНК высаживали 96% этанолом, растворяли в 16 мкл буфера ТЕ (10 мМ Трис-HCl, pH 8,0 при 25^oC, 1 мМ ЭДТА), наносили на 0,8% агарозный гель и проводили электрофорез при 120V. На рис. 9 также указаны расчетные длины фрагментов ДНК E.coli  ER2267, производного штамма Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 (GenBank acc. no. NC_000913, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000913.3), полученных при расщеплении по сайтам 5’-TTTTAAAA-3’. Как видно из рисунка, наблюдается хорошее соответствие расчетных и экспериментально полученных данных, что подтверждает установленную специфичность фермента AlsI.

Таким образом, фермент AlsI узнает и расщепляет последовательность ДНК 5’-TTT ^TAAAA-3’ как указано стрелкой.

Большинство из идентифицированных на сегодняшний день прототипов [9] распознают нуклеотидные последовательности длиной 4–6 п.н. К настоящему времени известно только около полутора десятков прототипов, сайты узнавания которых составляют 8 нуклеотидов, среди которых были обнаружены истинные палиндромы, прерванные палиндромы или палиндромы с вырожденными позициями. Описываемый в настоящей статье фермент является третьим прототипом, узнающим на ДНК восьминуклеотидную последовательность, представленную только АТ-парами: AlsI расщепляет 5’-TTT^TAAAA-3’, SwaI – 5′-ATTT^AAAT-3’ [10], PacI – 5’-TTAAT^TAA-3’ [11]. Новый фермент AlsI может найти применение в области генетической инженерии, молекулярной биологии, биотехнологии и ДНК-диагностики.

ЛИТЕРАТУРА

1. Pingoud A., Fuxreiter M., Pingoud V. and Wende W. Type II restriction endonucleases: structure and mechanism // CMLS, Cell. Mol. Life Sci. – 2005. – Vol. 62. – P. 685–707. – 1420-682X/05/060685-23. – DOI 10.1007/s00018-004-4513-1.
2. Дедков В.С. Определение содержания G+C в ДНК бактерий при помощи эндонуклеаз рестрикции // Биотехнология. – 2004. – № 4. – С. 77-82.
3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Пер. с англ. – М., – 1984.
4. Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study // J. Bacteriol. – 1991. – Vol. 173. – P. 697 – 703.
5. Nucleotide BLAST. URL: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov.
6. SILVAngs. URL: https://www.arb-silva.de/aligner.
7. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/
8. Rudra B., and Gupta R.S. Phylogenomics studies and molecular markers reliably demarcate genus Pseudomonas sensu stricto and twelve other Pseudomonadaceae species clades representing novel and emended genera // Front. Microbiol. – 2024. – 14:1273665.  https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1273665
9. URL: https://rebase.neb.com/rebase/rebase.enz.html
10. Lechner M., Frey B., Laue F., Anton-Botella J., Smith C.L., Ankenbauer W. and Schmitz G.G SwaI, a unique restriction endonuclease from Staphylococcus warneri, which recognizes 5′-ATTTAAAT-3′ // Nucleic Acids Res.. – 1992. – Vol. 20. – P. 2293–2296.

11. Polisson C. Type II restriction endonuclease obtainable from Pseudomonas alcaligenes and a process for producing the same // US Patent Office. – 1992. – Patent#: US 5098839.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

BSA – бычий сывороточный альбумин; ДТТ – дитиотреитол; Т7 ДНК – ДНК бактериофага T7; λ ДНК – ДНК бактериофага λ; е.а. – единицы активности; Трис – трис-(оксиметил)аминометан; ПААГ – полиакриламидный гель; п.н. – пары нуклеотидов; рестриктаза, ЭР – эндонуклеаза рестрикции; ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота.